磷酸钙转染 美国异体骨移植患者的人类免疫缺陷率为

据报道，美国同种异体骨移植患者的 HIV 感染率为 160 万分之一。近年来，人工材料，如羟基磷灰石和硫酸钙，已被用于填充骨缺损，但实际效果不如自体骨或异体骨。临床问题。 3D打印技术的兴起或为解决上述问题带来希望。

3D 生物打印是组织工程中的一种高速分析技术。技术，生物材料层层粘合，叠加成型，最终形成模拟组织或器官。 1999 年，Winder 等人。采用CT扫描和3D重建颅骨缺损形状，并应用3D打印技术快速打印出合适形状和尺寸的钛植入物，用于治疗患者颅骨缺损并取得成功。井川等人。利用3D打印技术，成功打印出植入骨骼的磷酸三钙，修复了狗头骨的缺损。骨组织的3D打印需要合适的高分子材料，在组织打印过程中可以保护细胞功能的完整性，同时保证打印后细胞营养物质在组织中的运输和废物的排出。如何构建3D骨模型，自然成骨，促进骨愈合，提高细胞存活率，降低免疫原性，成为骨组织3D打印需要解决和突破的重要研究课题。在现有研究工作和进展的基础上，我们总结出理想的3D骨组织打印原型：

(１）以骨缺损为原型，生物可吸收高分子化合物为材料，快速打印出具有骨硬度、孔隙率和细胞生长良好的结构支架；

(２）细胞可以粘附在支架上，可以增殖分化成骨，支架的多孔结构有利于氧气和营养，有利于骨组织的生长和血管生成，并且可以避免应力屏蔽效应；

(３）Bioscaffolds可以提供细胞生长和分化所需的细胞因子，如血管内皮生长因子促进血管生成，骨形态发生蛋白促进细胞增殖和分化，为细胞成骨提供持续的微环境。该技术可能是最有效的骨再生方法，甚至可以实现完美的骨重塑和关节重塑。

1.用于 3D 打印骨组织的生物支架

生物支架是3D骨组织打印的基础框架，需要易于打印目前主要有金属、生物陶瓷、高分子材料、高分子材料和生物陶瓷或金属与生物陶瓷的复合材料作为替代方案。

1.1金属支架

钛合金重量轻、强度高，并且具有出色的生物相容性，使其非常适合将植入物植入人体。将前成骨细胞种植在钛合金支架上培养，可检测到纤连蛋白、粘着斑蛋白、细胞数量、碱性磷酸酶和细胞外基质钙化结节的增加。钛合金支架的多孔结构可以促进前成骨细胞的粘附、增殖、分化和矿化。我们将多孔 3D 打印钛合金移植物植入绵羊的 C3-C5 椎体。 Miro-CT)扫描重建和组织染色可以观察到大量骨组织长入移植物。虽然3D打印的金属支架具有良好的生物相容性和较强的抗压能力，但金属支架打印需要在高温条件下进行。在打印过程中不可能同时包覆生物活性分子或混合细胞。

1.2个生物陶瓷支架

生物陶瓷具有很强的抗压性和良好的生物相容性由于具有强骨诱导能力等优点被广泛应用于组织工程研究。目前主要有磷酸钙、焦硅酸钙、双相磷酸钙制成的陶瓷支架、硅酸钙/β-磷酸三钙等。抗压强度可以满足松质骨的生物力学要求。 3D打印的陶瓷支架可以促进细胞的成骨分化和血管生成。羟基磷灰石支架可促进牙神经鞘干细胞的成骨分化。在双相磷酸钙支架中 β-磷酸三钙含量的增加可促进细胞的成骨分化，硅酸钙/β-磷酸三钙支架中硅的释放可促进成骨细胞样细胞合成BMP-２、TGF-β发挥成骨作用。 NAGEL支架促进人脐静脉内皮细胞增殖和血管生成。虽然陶瓷支架具有良好的生物相容性、较强的骨诱导能力和良好的抗压性能，但陶瓷支架还需要在高温下打印。在打印过程中，支架不能同时涂有促进骨形成的生物活性分子或抗感染药物。同时脆性大，韧性差，剪切应力弱。

1.3 种聚合物支架

高分子材料可促进成骨分化、细胞黏附、可控，还广泛应用于组织工程研究，如聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯等。聚己内酯支架与骨髓干细胞共印。体外研究发现，细胞表达碱性磷酸酶、骨钙素和 I 型胶原蛋白增加。将含有人重组骨形态发生蛋白的聚己内酯支架植入兔尺骨中段骨折部位。 ，随着支架的缓慢降解，观察到骨量显着增加。增加支架的粗糙度可以提高细胞的粘附能力。 RGD 和 PHSRN 在聚乙二醇分子上进行了修饰，并在体外培养了含有成骨细胞的 3D 打印生物支架。通过粘着斑染色增加成骨细胞粘附的数量。聚合物支架在增加新骨形成和促进细胞粘附方面具有很大优势，但与细胞混合的聚合物支架抗压能力较弱，不能满足人体骨骼的抗压要求。同时，高分子材料降解产生酸性产物，使局部pH值降低，会引起炎症反应；局部pH值的降低会加速高分子材料酯键的水解，促进高分子材料的降解，影响支架的生物力学效果。

1.4个复合支架

为了更大程度地满足3D骨打印支架的需求，高分子材料与陶瓷或金属与陶瓷混合制成的复合材料支架成为新的突破口。结合陶瓷支架和聚合物支架的优点，如骨组织中胶原蛋白和钙盐的有机结合，更接近真实的骨基质环境，被众多学者用于3D骨组织打印研究。高分子材料和陶瓷制成的复合材料具有增强的抗压能力，接近松质骨的力学性能。 β-硅酸钙/聚乙交酯复合支架在体外和体内研究中均显示出促进成骨和组织血管生成的能力。在复合支架中添加生物活性物质，如BMP-２、VEGF，可以进一步刺激支架内血管和骨量的增加。因此，涂覆有生物活性分子的复合材料将成为3D骨打印支架的最佳选择。最佳选择。

2.3D打印骨支架的多孔结构和微环境

在临床实践中，大量骨组织移植后，氧气和营养供应不足会降低移植后的存活率。重要原因之一。植入细胞可用的氧气会在数小时内耗尽，而局部血管生成需要数周才能输送氧气和营养物质，即大多数植入细胞可能会失去足够的氧气和营养物质功能或凋亡。 3D打印骨组织的多孔结构可以持续提供氧气和养分，同时消除应力屏蔽效应，其粗糙的表面形态可以促进细胞粘附。

2.1 孔径和孔隙率

3D 打印多孔组织的孔径、孔隙率和孔交联度都会影响细胞存活和组织向内生长。 1998 年，Kuboki 等人。据报道，移植物的多孔结构可以促进骨再生。将喷涂BMP-2的固体和多孔羟基磷灰石分别植入大鼠体内，发现固体羟基磷灰石表面无骨形成，而多孔羟基磷灰石内部有骨形成。 2003 年，罗伊等人。发现附着20％β-磷酸三钙的聚乳酸多孔接枝具有80％至85％的孔隙率和125至150μm的孔径。更多的数量。 Karageorgiou 等人。 (2005) 报道孔径交联可以提高养分转运、细胞迁移、细胞桥接和组织向内生长的能力。

2.2 血管生成

3D打印骨中的血管生成会影响体内植入后组织的功能重建也是衡量3D打印骨组织能否应用于临床的重要标准。骨内脉管系统向血管 100 μm 范围内的组织提供氧气和营养。有学者观察到，将嵌有细胞的工程骨植入体内后，距离血管100-200μm范围内的细胞可以获得营养供应。也有学者观察到，植入孔径为523 μm、孔隙率为70%的聚己内酯/磷酸钙支架后，骨缺损部位新生血管明显增多。有学者观察到孔径为275μm和400μm的3D打印支架内有大量新生血管，而孔径为100μm的支架内新生血管相对较少。骨组织的血管生成与新生血管的生长深度密切相关。

2.3促进成骨

3D打印骨组织的成骨分化是衡量工程骨质量好坏的主要指标，多孔结构有利于细胞增殖、分化，促进骨组织向内生长。明胶共印羟基磷灰石圆​​柱形多孔支架促进成骨细胞增殖，体内研究发现交联孔径为100-400μm、孔隙率为75%的支架更适合成骨细胞增殖和成骨分化。当双向磷酸钙支架孔径为300 μm时，促进细胞增殖的能力强于磷酸三钙支架。目前学者认为多孔支架促进成骨，但孔径、孔隙率和交联度最适合成骨，并没有统一的标准，这可能与不同的支架材料有关。

3.3D 骨骼和其他细胞的联合打印

3D 细胞打印技术是一种体外定植细胞的方法。在人工器官的特定位置构建三维多细胞系统的技术。生物体内的细胞和细胞外基质是按照一定的空间结构排列的。细胞在细胞外基质中的精确定位是维持生物结构、形态和功能完整性的必要条件。 3D骨组织打印同时打印细胞和支架，有利于支架上原位成骨，实现完美的骨再生。目前用于3D骨组织打印的细胞主要包括成骨细胞、胚胎干细胞、成体干细胞（脂肪、骨髓、间充质）、诱导多能干细胞和内皮细胞。

3.1成骨细胞和内皮细胞的共同打印

成骨细胞具有成骨分化能力，内皮细胞具有促进血管生成的能力。成骨细胞和内皮细胞共同打印在3D组织中，细胞通过直接接触、间隙连接、自分泌/旁分泌等途径相互交流，促进血管生成和骨组织形成。人真皮微血管内皮细胞和人骨肉瘤细胞MG-63细胞定植于3D打印骨组织中进行体外培养，观察到大量微血管样结构形成，分泌的VEGF水平升高，表达细胞间粘附分子的表达上调，MG-63细胞的存活时间显着增加。 HUVECs与人成骨细胞体外共培养时，VEGF、I型胶原和粘附分子的表达上调，碱性磷酸酶、骨钙素和Runx-2等成骨标志物的表达显着增加。原代细胞数量少，增殖能力较低，不适合大规模成骨。

3.2成体干细胞和内皮细胞的共印

成体干细胞具有多向分化潜能，增殖能力强于成骨细胞，可用于3D骨细胞打印。骨髓间充质干细胞或脂肪来源的间充质干细胞与HUVECs体外共培养可以观察到微血管样结构的形成，但HUVECs单独不能形成微血管样结构。有学者发现，原代成骨细胞与人内皮细胞共培养时，原代成骨细胞可通过产生细胞外基质和分泌VEGF来促进内皮细胞来源的血管生成。也有学者发现，MSCs和HUVECs体外共培养时，HUVECs抑制MSCs的增殖和成脂分化，而HUVECs通过上调β-catenin和pSmad1/5/8的表达来激活其内源性MSCs。间充质干细胞的细胞核。它可以促进Wnt和BMP信号通路的成骨分化。虽然干细胞具有多能分化的特性，但如何精确调控其定向成骨分化并协同血管生成仍是该领域尚未解决的重要科学问题。

3.3胚胎干细胞打印

胚胎干细胞在体外具有无限增殖、自我更新和多向分化的特点磷酸钙转染，容易诱导成骨。用于 3D 骨组织打印。培养人胚胎干细胞形成胚胎，取出间充质干细胞，种植在涂有海藻酸盐颗粒的碳酸钙支架上。细胞内碱性磷酸酶和骨钙素表达增加，钙盐沉积明显。如果将人胚胎干细胞来源的间充质干细胞种植在 RGD 修饰的 CPC 支架中，可以显着刺激成骨。胚胎干细胞虽然具有良好的成骨分化特性，但其成瘤率仍然无法避免，而且成本也极其昂贵，存在伦理问题。

3.4iPSCs 细胞打印

iPSCs细胞是通过基因转染技术引入体细胞的一些转录基因，在体内，体细胞直接重组为胚胎干细胞样多能细胞。由于胚胎干细胞在医学应用中的免疫排斥和伦理困境，学者们正在尝试用iPSCs细胞替代胚胎干细胞。将小鼠尾成纤维细胞重组为 iPSCs 细胞。转化生长因子-β1和转化生长因子-β2处理后，iPSCs细胞中RunX-２、OSX、OPN和OCN基因的表达水平升高。植入羟基磷灰石/碳酸三钙支架后，体内研究发现 iPSCs 表达增加的骨钙素。当 iPSCs 种植在经血浆处理的聚醚砜支架上时，碱性磷酸酶和骨钙素的表达显着增加。植入大鼠体内时，发现骨缺损部位形成的新骨量大，愈合快。用 pEB-C5 病毒转染人骨髓中的 CD34+ 细胞并重组为 iPSCs 细胞，在磷酸钙支架上培养和种植。骨基因表达水平显着增加，骨盐合成增加。将含有BMP-2基因的慢病毒转染iPSCs-MSCs并种植在碳酸钙支架上，显着促进了细胞的成骨分化和骨盐形成。虽然通过病毒转染在细胞中添加“重编程”基因或替换缺陷基因的方法可能会引起感染并可能产生细胞肿瘤性变化，但iPSCs技术不使用胚胎细胞或卵细胞，不存在伦理问题，同时制备iPSCs 是病人的体细胞，没有免疫排斥的问题，可以制备的细胞数量充足。

4.3D 打印骨组织和生物降解

3D打印骨组织植入体内促进骨缺损部位的功能重建，在骨功能重建过程中，细胞生成新的基质替代支架磷酸钙转染，最终达到骨组织缺损前的生理状态。材料降解的理想情况是新基体和材料的降解速率可以在时间和空间上同步，打印的组织材料降解不影响骨骼局部生物力学。王等人。发现β-CS/PDLGA复合支架植入兔体内，４、1２、26周的新骨形成率分别为16.33%、28.7%和26.37%。 ４、20周时支架的降解率分别为33.71%和65.72%，说明β-CS/PDLGA支架不仅具有骨诱导作用，促进骨形成，而且支架的降解率也有所提高。更接近新骨形成。速度。王等人。制备了具有良好骨传导性β-磷酸三钙和良好骨诱导性β-CS的混合多孔生物陶瓷支架，并将其植入股骨缺损处。他们发现β-磷酸三钙与β-CS的比例为1：1，４、1２、第26周新骨形成量分别为19.54%、30.00%、23.55 %，相应的支架降解率分别为19.48%、52.36%和66.81%，即支架的降解和新骨的形成几乎同步，使得骨组织的形成和支架的降解是时间和空间几乎同步，可以促进局部骨组织缺损的更快愈合。

随着研究的深入，3D打印骨组织在骨移植中的潜力越来越受到学者们的关注。 、细胞成骨分化、支架降解等方面具有重要作用。骨组织3D打印在骨科领域有着非常广阔的应用前景，比如骨肿瘤切除后的骨组织植入。北京大学第三医院完成了世界首例利用3D打印技术人工定制中轴椎体治疗寰枢椎恶性肿瘤的手术。该技术已在临床上用于脊柱外科手术。基于上述研究中骨组织3D打印的优势以及研究人员的进一步努力和探索，骨组织3D打印将是骨再生的未来。