【知识点】农药学学号、血浆蛋白结合率的测定

实验3测定血浆蛋白结合率.docx

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1、实验3：血浆蛋白结合率的测定部门：理学院专业：农药科学学生ID：*姓名：王毅实验3：血浆蛋白结合率的测定1、测定实验目的 不同动物中磺胺嘧啶钠的血浆蛋白结合。 2、实验原理 蛋白质放置在一个隔室中，通过半透膜与另一个隔室隔开。蛋白质等大分子不能通过这种半透膜，但系统中的自由配体可以自由通过。当达到平衡时，半透膜两侧的游离配体浓度相等。如果系统中游离配体的总量已知，则可以通过测量无蛋白质隔室中游离配体的浓度来估计与蛋白质结合的配体量。具有游离氨基的磺胺类药物在酸性介质中与亚硝酸发生重氮化反应后，可与N-(1萘基)乙二胺偶合生成紫红色偶氮染料，与处理过的标准磺胺类药物相同。以同样的方式。 721分光光度计比色法测定组织中和作用

2、不同时间血液中磺胺嘧啶的浓度。由于亚硝酸的不稳定性，在实验中，它是由三氯乙酸与亚硝酸钠反应得到的。剩余的过量亚硝酸会影响测定，并通过与氨基磺酸盐一起分解而去除。 3、实验材料1、一只实验动物，一只兔子。 2、设备及仪器712分光光度计，管状半透膜（周长5cm，长约12cm），丝线，广口瓶，移液器。 3、药品和试剂 10%磺胺嘧啶钠注射液 15%三氯乙酸溶液0.1%亚硝酸钠溶液0.5%氨基磺酸溶液0.1%二盐酸N-(1-萘基)-乙二胺溶液磺胺嘧啶钠储存标准溶液磺胺嘧啶钠应用标准溶液4、试验方法1、试剂制备0.1%二氢N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐溶液：< @0.5克溶于约400毫升95%乙醇中，再用乙醇稀释至500毫升，棕色瓶

3、将透析液 (PBS) 保存在冰箱中：0.02M 磷酸盐缓冲盐水，pH7.4 和 0.15M NaCl 磺胺嘧啶 应用标准溶液：10% 磺胺嘧啶钠注射液3.75l溶于约80ml 3%三氯乙酸溶液中，稀释至100ml容量瓶备用2、血浆制备兔心血，肝素抗凝，3000rpm离心10min , 取上清液作为血浆。 3、透析 将管状半透膜一端折叠，用纱扎紧，结扎段保持10cm左右，调整袋内外液面水平，加2.@ >0ml血浆样品到上述半透膜袋内，并扣紧袋子的另一端，袋口不得污染血浆。将两端绑紧的半透膜放入装有9.75ml透析液的30ml广口瓶中，用袋子两端的线段调节袋子内外液位，加< @0.05mg/ml磺胺嘧啶钠溶液0.5m

4、l 在每个瓶袋外的透析液中。将罐子放入冰箱，平衡透析约 60 小时。从袋中吸出少量透析液，加入等量的磺基水杨酸试剂。无混浊，说明血浆蛋白无渗漏。取出半透膜，用滤纸擦干袋外壁的透析液，小心解开透析袋，让袋内的血浆流入干净的试管中。 4、采用重氮化-偶联比色法测定袋内外溶液中磺胺类药物的浓度。取袋内外各溶液0.5ml，加水15.5ml；加入4ml 15%三氯乙酸，混匀，静置2min，过滤，取3支试管，每支加入5mL滤液，作测定管；取3支试管，加入5mL空白对照溶液，即为空白管；取3支试管，加入5mL应用标准溶液，即为标准管，在上述各管中加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，静置3min，各加入0.5%氨基磺酸溶液0.5mL，搅拌均匀血浆蛋白结合率大的药，放

5、静置2min，加入0.1%二盐酸盐N-(1-萘基)-乙二胺溶液2.@>各5mL，混匀血浆蛋白结合率大的药，静置10min，使用721分光光度计在550nm波长比色：用空白管校准光密度至0点，读取标准管和量管的光密度，用公式计算：量管光密度游离磺胺药物含量（mg%）=应用标准溶液 用标准管5、的光密度稀释样品浓度，计算血浆蛋白结合率。 Dt - Dffb= -100% Dtfb：血浆蛋白结合率； Dt：血液中总药物浓度（透析袋中血浆药物浓度）； Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药物浓度）五、实验结果1、结果记录表1：标准管和测量管的光密度测量结果分别为相同的。第二个样本和第三个平均值在透析袋外。

6、0.008 透析袋0.065 0.090 0.061 0.072 标准溶液0.690 < @ 0.701 0.680 0.6902、游离磺胺类药物含量计算：透析袋内药物浓度=0.000044mg/ml透析袋外药物浓度= 0.00039mg/ml3、药物血浆蛋白结合率计算结果：兔：fb=88.9%六、结果讨论与总结1、光谱操作的光度计。由于要使用一套比色杯来测量吸光度，在实际应用中，比色杯使用混乱，没有严格清洗，因此吸光度的测量存在较大误差。分光光度计使用注意事项：(1）为防止光电池疲劳。不测量时，必须打开比色皿暗箱盖，切断光路，延长使用寿命。光电池的寿命。(2）@ >Naby

7、使用比色皿时，手指只能握住比色皿的磨砂玻璃表面，不要接触比色皿的透光面，以免污染。 (3）清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水冲洗。每次实验后，立即清洗比色皿。(4）测量有色溶液的吸光度时，一定要清洗试管内壁多次用有色溶液，以免改变有色溶液的浓度。 .(5）在实际分析工作中，通常根据溶液浓度选择不同厚度的液槽比色皿，使溶液的吸光度控制在0.20.7.2、总结动物种类、生理病理状态、个体差异等都会影响血浆蛋白结合率，理论上所有与蛋白相互作用的药物在蛋白浓度高时都能结合够了。但在实践中，当亲和力低时，不可能达到这种所谓的足够高的蛋白质浓度。在蛋白质浓度不变的情况下，当药物浓度在一定范围内增加时，结合药物的量会增加，但结合分数会降低。相反，当药物浓度降低时，结合分数会增加并逐渐趋于最大值，因此不同药物在低浓度下的最大结合率是不同的。平衡透析是一种相对简单可行的操作方法，不需要复杂的设备。实验中三角烧瓶、动液管、试管等没有彻底清洗干净，会影响实验结果。同一动物的不同动物种类和个体差异会影响实验结果，操作者的失误也会影响实验结果。药物 浓度和血浆蛋白浓度都会影响结合率。报告血浆蛋白结合率时，必须同时注明实验中使用的药物浓度和蛋白浓度。