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时间：2022-05-07 14:01:56来源：网络整理
DNA突变及报告基因载体的构建
使用重叠延伸方法，通过PCR对目标位点的序列进行突变。根据每个突变位点，设计并合成突变位点的特异性引物。然后，以正确测序的野生型报告基因质粒为模板，通过两次PCR，将靶序列一一突变。将突变片段经回收、酶切、连接、转化等步骤（具体方法与构建野生型相同）后分别克隆到pGL3-Basic报告基因载体中。构建的质粒经酶切鉴定后送公司测序。
转染细胞和缺氧处理
(1) HeLa 细胞在 35 mm 培养皿中生长至 50%-80%。
(2）取 100 μl 无血清、无抗生素 DMEM，加入 1. 5ml Eppen-dorf 管，加入 10 μl 脂质体（LipofectAMINETm 试剂），静置 40 分钟。
(3）取 100 μl 无血清、无抗生素 DMEM，加入 1. 5ml Eppendorf 管，加入 2μl pGL3-靶基因重组或载体 pGL3-basic，或 2μl 水 30分钟。
(4）将步骤 2 和 3 的液体混合，静置 15 分钟。
(5）加入 800μl 无血清、无抗生素的 DMEM 并混合。
(6）吸出 35 mm 培养皿中的 DMEM，用 1 ml 无血清、无抗生素 DMEM 清洗一次，然后丢弃。
(7）将 1 ml 步骤 5 的混合液加入 35 mm 培养皿中点突变技术点突变技术，孵育 5 小时。
(8）吸出不含血清、不含抗生素的 DMEM，用 1 ml 含 15% 血清的 DMEM 洗涤两次。
(9）加入1ml含15%血清的DMEM培养16h。
(10）细胞缺氧培养36h。
裂解细胞
(1)吸出培养基。
(2）轻轻加入足够的 PBS 以洗去未贴壁的细胞和残留的培养基。
(3）加入100 μl/孔（24孔板）1×PLB，室温摇晃15分钟。
(4）取上清液检测。
荧光素酶活性测定
(1）测量前，提前30分钟开启TD20/10预热。
(2）先在流管中加入 40 μl LAR II。
(3) 然后加入 20μl PLB 细胞裂解液并用移液器吸头混合。
(4）快速将试管插入机器，测量萤火虫荧光素酶活性。
(5）取出试管，加入40μl Stop&Glo，混匀。
(6) 快速将试管插入机器中测量海肾荧光素酶活性。
典型的实验结果。
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